上海信帆生物科技有限公司為了建立能穩定分泌高親和力、高特異性抗大鼠胃泌素單克隆抗體的雜交瘤細胞株,在對其親和力、特異性以及生物學功能進行鑒定的基礎上,克隆抗大鼠胃泌素單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區基因,構建抗大鼠胃泌素單鏈抗體基因,在大腸桿菌中誘導表達,并對表達產物進行初步鑒定。

       以胃泌素合成肽與鑰孔戚血藍蛋白的偶聯物為免疫原,采用雜交瘤技術建立能穩定分泌高親和力抗大鼠胃泌素單克隆抗體的雜交瘤細胞株,大量制備并經鹽析、蛋白G親和層析獲得純化的單克隆抗體,采用SDS-PAGE對抗體進行分子量和純度鑒定,間接ELISA法檢測效價,雙向瓊脂擴散實驗鑒定類和亞類,非競爭酶免疫實驗測定親和力,斑點ELISA和免疫組化鑒定特異性,并且分別采用熒光染色法和MTT比色法,研究其對胃泌素/胃泌素受體結合的阻斷作用,以及對SGC-7901細胞增殖的抑制作用.在此基礎上,選擇雜交瘤細胞株E8,用TRIZOL試劑提取總RNA,通過RT-PCR,采用小鼠重鏈可變區和輕鏈可變區通用引物,擴增抗體可變區基因.通過重疊延伸PCR將兩個可變區基因通過連接肽基因連接起來,構建單鏈抗體基因,克隆到pGEM-T載體中,通過酶切、PCR和測序進行鑒定.然后用限制性內切酶雙酶切pGEM-gastrin-ScFv質粒和pET-28a(+)質粒,構建pET-gastrin-ScFv重組表達質粒.轉化大腸桿菌BL21(DE3)后,篩選陽性菌株,通過酶切、PCR進行鑒定.陽性菌株經IPTG誘導培養后,分離包涵體,進行變性和復性處理,通過SDS-PAGE和競爭抑制ELISA對表達蛋白的分子量和活性進行初步鑒定.