原位雜交（DAB）

服務介紹：

原位雜交原理：原位雜交是指將特定標記的已知序列核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細胞標本或組織標本上進行。

實驗流程：

1、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。

2、脫水：組織固定完成后經梯度酒精脫水后浸蠟，包埋。

3、切片：石蠟經切片機切片，攤片機撈片，62°烤箱烤片2h。

4、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

5、消化：根據組織固定時間長短，切片于修復液中煮沸10-15分鐘，自然冷卻。后基因筆畫圈，根據不同組織不同指標特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20-30 min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。

6、阻斷內源性過氧化物酶：滴加3%甲醇-H2O2，室溫避光孵育15min，將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

7、預雜交：滴加預雜交液，37°C孵育1h。

8、雜交：傾去預雜交液，滴加含探針雜交液, 恒溫箱 37度雜交過夜。

9、雜交后洗滌：洗去雜交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌。

10、滴加封閉液：滴加封閉血清正常兔血清。室溫30min。

11、滴加鼠抗地-高辛標記過氧化物酶(anti-DIG-HRP)：傾去封閉液，滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育40min，后PBS洗4次×5min。

12、DAB顯色：切片稍甩干后，在圈內滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，純水沖洗切片終止顯色。

13、復染細胞核：Harris蘇木素復染3min左右，自來水洗，1%鹽酸酒精分化數秒，自來水洗，氨水返藍，流水沖洗。

14、脫水封片：將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精I 6min—100%酒精II 6min-正丁醇6min—二甲苯透明，將切片從二甲苯中拿出稍晾干后，中性樹膠封片。

15、顯微鏡檢，圖像采集分析。

結果判讀：

陽性為棕黃色，細胞核為藍色。 

送樣要求：

1、切片前處理要求：新鮮組織干冰運輸后做冰凍切片；或取2mm左右厚度的新鮮組織，5min內投入原位雜交固定液內固定，4℃低溫保存運輸，切勿冷凍結冰，盡快包埋切片后進行原位雜交實驗，固定時間過長影響核酸檢出率；

2、冰凍切片：冰凍切片-20℃運輸；

3、石蠟切片：石蠟切片常溫運輸；

4、細胞爬片：細胞爬片加原位雜交固定液固定15min后，換無酶PBS，密封，4℃運輸。 

單據填寫：

1、探針合成：需提供待測目的基因序列或基因登錄號、所需標記類型；

2、自帶探針需告知完整探針信息；

3、寫明檢測要求。